透明质酸诱导促进人神经脊细胞向牙周韧带干细胞样细胞的分化

北海道大学大学院

组成牙周组织的一部分，被称为牙周韧带（PDL）的组织，当PDL损伤到无法修复的程度时，就会成为牙周炎，最后可能会失去牙齿。牙周组织中包含具有再生牙周组织能力的牙周组织干细胞（PDLSC），但牙周组织中PDLSC的数量被认为非常少，自体PDLSC的移植因此受到限制。神经嵴（NC）细胞可以分化为多种细胞和组织，部分NC细胞通过留在颅神经嵴中产生PDLSC。因此，考虑将牙周组织中的NC细胞分化为PDLSC，有可能促进牙周组织的再生。然而，大量获取NC细胞的难度是限制NC细胞在再生研究中应用的主要因素。因此，我们将神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH作为牙周组织再生的牙周组织干细胞培养方法的重点，并开发了一种新的细胞培养支架。

首先，从人类牙齿的根面剥离PDL进行培养，获得人类PDLC（HPDLC）。进一步培养HPDLC，并通过处理和剥离，得到了由HPDLC衍生出的ECM（HPDLCs-ECM）涂层后的培养皿。在这个培养皿中播种并培养SK-N-SH细胞，获得SK-N-SH细胞衍生的PDLSC细胞（SK-PDLSC）。通过qPCR分析发现，与SK-N-SH细胞相比，SK-PDLSC在PDL相关基因的表达上显著提高。此外，为了研究SK-PDLSC的分化能力，我们还分析了骨母细胞相关基因和脂肪细胞相关基因的表达水平。骨母细胞相关基因和脂肪细胞相关基因的表达水平均显著较高，这些结果证明SK-N-SH细胞作为从NC诱导PDLSC分化的模型是有用的。

过去的研究显示，从iPS细胞衍生的NC(iNC)分化为iPDLSC时，透明质酸(HA)相关基因的表达水平较高。在本研究中，对iNC和iPDLSC中的HA基因表达水平进行分析时，发现HA相关基因如过去的研究一致，依然存在。基于这一发现，当观察SK-N-SH细胞和SK-PDLSCs中的HA相关基因表达时，HA相关基因在SK-PDLSCs中的表达水平高于SK-N-SH细胞。HA的表面受体CD44通过活性化诱导细胞内信号传导路径的启动。这个CD44抗原在牙周组织中表达，HA-CD44相互作用与PDL细胞增殖和钙化相关。我们使用CD44表达的SK-N-SH细胞调查了HA信号传导在SK-PDLSC分化中的作用。当将CD44+SK-N-SH细胞培养在涂覆了HPDLSCs-ECM的孔中时，PDL相关基因的表达显著提高。此外，通过使用siRNA的实验确认抑制CD44会降低分化能力。

从这些结果可以判断，CD44是SK-N-SH细胞向SK-PDLSC分化的重要调节因子。以往的研究报告表明，HA分子对各种种类的干细胞和前体细胞的分化有影响。基于这一发现，我们使用高分子透明质酸（HMWHA）和低分子透明质酸（LMWHA）研究了HA对SK-N-SH细胞向SK-PDLSCs分化的效果。在HPDLCs-ECM和LMWHA存在下培养的SK-PDLSC，通过LMWHA的初次刺激，CD44和PDL基因的表达水平显著提高。接下来，我们将LMWHA混合到PCL溶液中，利用静电纺丝技术制造纳米纤维膜。

※实验使用了MECC的静电纺丝设备。

在确认纳米纤维膜释放的HA浓度足够后，将纳米纤维膜放置在播种了SK-N-SH细胞的孔中进行细胞培养，并检查了培养细胞中CD44和PDL相关基因的表达。结果表明，在HPDLCs-ECM和LMWHA混合纳米纤维膜的存在下培养的SK-N-SH细胞，其CD44和PDL相关基因的表达水平显著提高。这被认为是膜内HA的释放以及持续刺激导致PDL相关基因表达增加的结果。

以上的研究表明，SK-N-SH细胞作为牙周组织再生的细胞培养模型具有实用性。此外，使用释放LMWHA的生物降解支架，可以激活和分化PDL中的NC，增加PDLSC的数量，期待能够让受损的牙周组织再生。据说未来将进行体内适应性实验，并继续进行调查。