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J. Dent.:仿生电纺膜作为潜在骨再生材料的体外研究

2020-05-08   易丝帮

DOI:10.1016/j.jdent.2020.103359

目的:评估新型电纺复合膜(有机聚合物/二氧化硅纳米颗粒)的表面特征和成分,以提高成骨细胞的活性。

方法:膜是由一种新型聚合物共混物组成的,是两种亲水性共聚物2-羟甲基丙烯酸乙酯-共聚-甲基丙烯酸甲酯和2-羟乙基丙烯酸酯-共聚-丙烯酸甲酯的混合物,并掺有二氧化硅纳米粒子。然后用锌或多西环素对膜进行功能化。通过原子力和扫描电子显微镜(FESEM)对膜进行形态学表征,并使用纳米压头进行机械探测。评估了仿生磷酸钙在聚合物组织上的沉淀。使用人骨肉瘤细胞进行细胞活力检测。采用FESEM研究了细胞形态。通过ANOVA、Student-Newman-Keuls和Student t检验分析数据(p<0.05)。

结果:二氧化硅掺杂提高了膜的生物活性和机械性能。膜的形态和机械性能与小梁骨相似。锌和多西环素的掺杂没有引起变化,但增加了新型膜的生物活性。研究发现该膜允许成骨细胞增殖。二氧化硅掺杂有利于细胞增殖和扩散。接种后24小时,掺硅膜中的细胞通过丝状伪足牢固地附着在实验组织上,彼此相连。细胞在表面产生胶原蛋白和矿物质。

结论:二氧化硅纳米粒子增强了电纺膜的表面性能和成骨细胞的活力。

临床意义:二氧化硅掺杂基质促进磷酸钙沉淀的能力、加上其机械性能、无毒性、对成骨细胞有刺激作用、其表面化学允许蛋白质共价结合,为骨再生应用提供了潜在的策略。

 

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图1.实验膜(n=3)的锌螯合能力a)和多西环素功能化值b)。


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图2.膜表面的AFM图像:a)COOH-膜、b)COOH-Si膜、c)Zn-Si-膜和d)Dox-Si-膜。可以观察到重叠和随机分布的纳米纤维。所有表面呈现相似的形态。


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图3.SBF浸没7天后膜的FESEM显微照片显示:a)COOH-膜中观察到很少或没有圆形矿物沉积物,b)COOH-Si-膜,c)Zn-Si-膜和d)Dox-Si-膜。纳米纤维失去了光滑的外观。矿物沉积物均匀分布在整个纳米纤维表面(b、c和d)。在EDX分析二氧化硅负载的膜后鉴定出钙和磷酸盐(Ep1、Ep2、Ep3和Ep4分别对应于图像a、b、c和d)。EDX光谱中也存在硅。镁和铝是样品架中的污染元素。


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图4.扫描模式下膜表面的纳米DMA分析:a)COOH-膜、b)COOH-Si-膜、c)Zn-Si-膜和d)Dox-Si膜。属性图对应于复数(E *)、损耗(E)、储能模量(E’)和正切增量(δ)。扫描区域为20 x 20 µm。比例尺对应于GPa的值。


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图5.不同膜的Alamar蓝测试后获得的荧光平均值和标准偏差。每张膜接种1.6 x 106 HOS TE85人骨肉瘤细胞,并培养至不同的时间点。没有将成骨诱导剂添加到培养基中。实验一式三份进行。相同的大写字母表示培养1天后膜之间无显著性差异。相同的小写字母表示培养3天后膜之间没有差异。相同的符号表示培养7天后膜之间没有差异。鉴于相同的膜,数字表示时间点之间的差异。如果p<0.05,则学生Newman Keuls多重比较均显著。


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图6.接种有成骨细胞并培养了24h、7和14天的实验膜的表面FESEM图像。每个组织接种1.6 x 106 HOS TE85人骨肉瘤细胞。在没有成骨诱导剂的情况下培养细胞。以下图像对应于COOH膜上的细胞:a)24h后,在膜上观察到一些扁平且细长的细胞(指针)。可以观察到长的成骨细胞丝状伪足穿过膜表面(箭头),它们比膜中的纤维粗。b)7d后,在更高的放大倍数下,观察到成骨细胞被细胞外物质覆盖(指针),丝状伪足与膜纤维混合在一起(箭头);c)14d后,可以看到几个相互连接的定向成骨细胞(指针),在表面上检测到大量丝状伪足(箭头)。下列图像对应于COOH-Si-膜上的细胞:d)24h后,在高倍放大下,成骨细胞以及它们之间的融合(指针)清晰可见,成骨细胞胞浆中也可见许多丝状伪足(箭头);e)7d后,在膜表面上检测到成骨细胞(指针),它们部分被纤维状物质和丝状伪足(箭头)覆盖,还可以看到一些矿物质沉积物(双箭头);f)14d后,成骨细胞被矿物质沉积物覆盖(双箭头),在表面上也观察到微小的晶体(箭头)。以下图像对应于Zn-Si-膜上的细胞:g)24h后,观察到大的成骨细胞(指针)并且彼此融合,可见细胞质中出现的丝状伪足(箭头),在膜表面检测到一些矿物质沉积(箭头);h)7d后,大的成骨细胞(指针)和大量丝状伪足(箭头)与膜紧密接触并在膜深处相遇;i)14d后,可以看到一些成骨细胞(指针),但大多数成纤维细胞被纤维状物质和带有晶体的矿质沉淀物(箭头)覆盖,成骨细胞被这种新产生的矿化材料完全覆盖。最后的图像对应于Dox-Si-膜上的细胞:j)24h后,在膜表面检测到大的成骨细胞(指针)和厚的丝状伪足(箭头);k)7d后,可见部分被纤维状物质覆盖的成骨细胞(指针),还观察到矿物质沉积(双箭头)和晶体(箭头);l)14d后,细胞附着在膜表面(指针),细胞产生大量的细胞外基质和纤维,在某些情况下不易与膜的纳米纤维区分,成骨细胞产生的纤维部分或完全覆盖了细胞,微小的晶体散布在细胞膜或新产生的纤维上(箭头)。当二氧化硅存在于膜成分中时,细胞附着和扩散、纤维生产和矿物质沉积均得以增强。


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