DOI:10.3390/cells9051207
受伤肌腱的再生极具挑战性。而组织工程是一个很有前途的解决方案。本研究验证了这样一个假设，即羊膜上皮细胞(AECs)的反应可以通过模拟肌腱的纤维直径大小来调节。尤其是，对具有两种不同直径尺寸（分别为1.27和2.5 µm：ha1-和ha2-PLGA）的高度定向微纤维的电纺聚丙交酯-乙交酯（PLGA）的AECs能力进行了测试，通过分析肌腱相关标记物（I型胶原：COL1蛋白和mRNA硬化：SCX，Tenomodulin：TNMD和COL1基因表达）测定其向十种基因谱系分化的能力，并且通过研究促（IL-6和IL-12）和抗（IL-4和IL-10）炎症细胞因子测定了其免疫调节性能。观察到，纤维排列而不是纤维尺寸影响细胞形态，这决定了AECs从立方体到梭形肌腱样的形态变化。相反，羊毛的机械性能、细胞增殖、肌腱分化和免疫调节是通过改变ha-PLGA超细纤维直径大小来调节的。具体而言，在ha2-PLGA上发现了更高的DNA量和更好的羊毛渗透性，而纤维直径较小的ha1-PLGA羊毛具有较好的机械特性，通过将SCX更有效地转化为下游效应物TNMD，从而在AECs向十种基因谱系的转分化上更高效。而且，相对于2.5μm的纤维直径，1.27μm的纤维直径以有利的IL-12/IL-10比率诱导了更高的促再生、抗炎性白细胞介素mRNA表达（IL-4和IL-10）。结果表明，纤维直径是设计用于组织修复的肌腱仿生纤维时要考虑的关键因素，并为控制基质参数在增强细胞分化和免疫调节中的重要性提供了新的见解，无论是移植的宿主组织内功能化的细胞还是移植的宿主组织。
图1.电纺PLGA超细纤维的形态特征。（A和B）具有1.27±0.11 µm（ha1-PLGA）和2.5±0.27 µm（ha2-PLGA）高度定向PLGA的SEM显微照片，显示无缺陷的羊毛（每种类型的羊毛n=3）。比例尺=10 µm。（C）ha1-和ha2-PLGA羊毛内纤维取向的频率分布。两种PLGA羊毛纤维均显示一条急弯高斯曲线，其取向角主要在-10°到+10°之间，并且在纤维直径较小的情况下，高度纤维排列具有统计学显著性（ha1-PLGA，p<0.05）（每种羊毛n=3）。
图2. ha1-和ha2-PLGA超细纤维的纤维直径和孔径。（A）直方图显示ha1-PLGA超细纤维的直径尺寸为1.27±0.11 µm（ha1-PLGA），而ha2-PLGA超细纤维的直径尺寸为2.5±0.27 µm。****ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛之间具有统计学显著性（p<0.0001）。（B）PLGA羊毛中孔径的频率分布，其中ha1-PLGA的平均孔径为2.37±0.24 µm，ha2-PLGA的平均孔径为3.92±0.39 µm。（C）比较结果表明，ha-PLGA羊毛的纤维直径尺寸增加，同时孔径显著增加（p<0.0001）（每种类型羊毛n=3）。
图3.ha1-和ha2-PLGA羊毛在灭菌前后的代表性FTIR光谱。光谱显示灭菌前后，纯ha1-和ha2-PLGA羊毛的化学组成没有差异。PLGA表征的官能团如下：酯羰基伸展（C=O）的1748 cm-1处，醚基伸展（C-O-C）的1085 cm-1处，以及甲基伸展（C-H）和（C-CH3）的1452和1044 cm-1处。
图4. ha1-和ha2-PLGA羊毛的机械特性。（A）最大负荷（N）；（B）断裂应变（％）； （C）极限抗拉强度（MPa）；（D）在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上进行的杨氏模量（MPa）测定（每种类型羊毛n=5，羊毛尺寸：50 mm×15 mm）。与ha1-PLGA相比，电纺ha2-PLGA羊毛具有更高的断裂应变值，而与ha2-PLGA相比，ha1-PLGA羊毛具有更高的杨氏模量值。****ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛之间具有统计学显著性（p<0.0001）。
图5.细胞接种效率和纤维直径尺寸对oAECs增殖的影响。将细胞接种在陪替氏培养皿（oAEC）或ha1-PLGA和ha2-PLGA电纺羊毛上，并使其生长长达48小时。（A）培养4小时和48小时后，通过Qubit®dsDNA HS分析对培养皿或接种的羊毛上的oAECs进行DNA定量，以验证细胞粘附性、接种效率并评估DNA量。结果表明，培养48小时后，与ha1-PLGA相比，ha2-PLGA的增殖速率更高。****同一样本类型在不同时间点具有统计学显著性（p<0.0001）。°°°°在48小时不同样本类型之间的统计显着性（p <0.0001）（每种样本/分析/时间点n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。（B）比较显示，在培养48小时后，与ha1-PLGA相比，ha2-PLGA的DNA量显著增加（p<0.0001），从而证明了ha-PLGA羊毛孔径的增加伴随着细胞增殖速率的增加。
图6.羊膜上皮干细胞（AEC）的活力和在ha1-和ha2-PLGA羊毛上的分布。（A和B）代表性图像，评估在两种类型羊毛上用钙黄绿素AM /碘化丙啶（PI）染色（分别为绿色和红色荧光）培养7天的oAECs的存活情况，其中只有活细胞可见，为绿色。细胞核用Hoechst 3342（蓝色荧光）复染，比例尺=50 µm。（C）直方图，显示培养24 h、48 h和7天后，接种在ha1-PLGA或ha2-PLGA羊毛上的细胞的oAECs活力。三组间无统计学差异（p>0.05）；（对于每种类型羊毛/时间点，n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。（D-G）代表性XY共聚焦图像，显示培养24 h和48 h后ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛内的oAECs分布。深度编码的MaxIP分析用于通过定义与细胞方向相关的渐变颜色来评估羊毛中的细胞穿透（可见为浅色背景）。渐变标度的紫色是指羊毛的表面，而红色是指表面的底部。因此，最表面的细胞质细胞显示为绿色，而位于羊毛底部的细胞的细胞质显示为红色。同样明显的是，oAECs在羊毛中具有最佳的分布，尤其是在培养24小时后的ha2-PLGA中，而在培养48小时后的ha1-和ha2-PLGA羊毛之间，在细胞渗透方面没有差异。插图显示了用MaxIP分析的相同鬼笔环肽标记的细胞显微照片。从这些图像中可以明显看出，附着在定向纤维上的细胞呈梭状形态。从明场曝光中捕获的羊毛显示细胞与纤维平行排列。比例尺=50 µm。
图7.oAECs在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上的形态。（A）由鬼笔环肽染色（红色荧光）证实oAECs形态的代表性共聚焦图像，其中用DAPI复染的核（蓝色荧光）。显然，陪替氏培养皿上的oAECs保持其典型的上皮形状，而在ha1-和ha2-PLGA羊毛上培养24小时时，它们就已经获得了肌腱细胞样的细长形态。比例尺=50 µm。（B）在ha-PLGA羊毛上接种24小时和48小时后伸长的oAECs的百分比。****每个时间点不同研究组之间的统计学显著性值（p<0.0001）。（C）接种在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上24小时和48小时后细胞核长宽比的百分比。 ****每个时间点不同研究组之间的统计学显著性值（p<0.0001）。§同一组在不同时间点的统计显著性值（p<0.0001）（对于每种类型羊毛/分析，n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。
图8.ha1-和ha2-PLGA羊毛在AECs上的张力感应特性。IHC分析显示，当接种到ha1-PLGA和ha2-PLGA上时，oAEsC中的COL1蛋白表达（红色荧光）。而培养皿上培养的细胞不表达蛋白质。DAPI（蓝色荧光）染色细胞核。图像显示，接种在培养皿上的细胞从不表达COL1，而在培养了24小时的ha1-和h2-PLGA羊毛上培养的AECs中却表达了COL1。在带有肌腱样形态的oAECs的细胞质中，COL1的阳性率是明显的。比例尺=50 µm（每种样品/时间点n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。
图9.ha-PLGA羊毛在AECs上的张力感应特性。在24 h和48 h培养点评估SCX、COL1和TNMD基因表达。定量RT-PCR数据显示，与培养皿上的oAECs相比，接种到ha-PLGA羊毛上的oAECs中的腱生标记的表达明显更高（参照样本oAECs在24 h时为1）（每种样品/分析/时间点n=3，羊毛尺寸：15 mm×7 mm）。*在每个时间点不同组之间的统计显著性（p <0.05）。**在每个时间点不同组之间的统计显著性（p<0.01）。***在每个时间点不同组之间的统计显著性（p<0.001）。 ****在每个时间点不同组之间的统计显著性（p<0.0001）。°同一组在不同时间点具有统计学显著性（p<0.05）。°°在同一组中不同时间点具有统计学显著性（p<0.01）。
图10.接种在ha1-和ha2-PLGA羊毛上的oAECs中的抗炎和促炎ILs表达谱。 （A和B）在oAECs中以及培养24小时、48小时和7天后在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上接种的oAECs中研究了促炎性IL-6和IL-12以及（C和D）抗炎性IL-10和IL-4 mRNA的表达。在培养皿上培养24小时后的oAECs用作参照样品（24小时的oAECs为1）。（E）培养7天（7d）后，oAECs中和接种在ha1-PLGA和ha2-PLGA羊毛上的oAECs中的表达水平的IL-12/IL-10比。在陪替氏培养皿上培养7天后的oAECs用作参照样品（7d的oAECs为1）。使用ΔΔCt方法进行相对定量，并将GAPDH用作管家基因。数据是在从至少3个胎儿（n=3次生物学重复实验）收集的oAECs中进行的3次重复实验（n=3次重复实验）的平均值±SD。*在每个时间点不同组之间具有统计学显著性（p<0.05）。**在每个时间点不同组之间具有统计学显著性（p<0.01）。***在每个时间点不同组之间具有统计学显著性（p<0.001）。****在每个时间点不同组之间具有统计学显著性（p<0.0001）。
