DOI:10.1038/s41598-020-65064-3
心肌组织工程策略具有在心肌梗塞后再生功能性心肌的潜力。在这项研究中，利用不同硬度（50.0±11.2 kPa和90.0±16.4 kPa）的新型电纺纤维蛋白微纤维片材来设计血管化心脏组织的仿生模型。研究者表征了培养在这些片材上的新生大鼠心室心肌细胞（NRVCMs）的组织组装、电生理和收缩性。在较软基质上培养的NRVCMs表现出更高的传导速度（CVs）和改善的电生理特性。当与人脂肪来源的干/基质细胞（hASCs）共培养时，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在片材上形成致密的网络。为了获得血管化的心脏组织，研究者测试了NRVCM:hASC:HUVEC的不同培养方案，发现1,500,000:37,500:150,000个细胞/cm2的比例能够形成坚固的内皮网络，同时保持与仅NRVCM相同的统计学电生理特性。以这种比率在90 kPa基底上进行培养时，其平均CVs为14±0.6 cm/s，动作电位持续时间（APD）80和APD30分别为152±11 ms和71±6 ms，最大捕获率（MCR）在3.9±0.7 Hz时获得。这些数据表明，作为生理性3D心脏模型，在体外产生紧密堆积的内皮网络以及电整合的心脏细胞的潜力巨大。
图1.实验设计示意图。制备并表征了两种浓度（0.75％和2.0％纤维蛋白）的纤维蛋白微纤维片。将NRVCMs以不同的播种密度培养在纤维蛋白微纤维片上以确定合适的培养条件。最初尝试将与之前单层研究类似的细胞培养比例用于三培养。由于此操作不成功，因此采用了分步共培养方法。进行NRVCMs和hASCs的共培养以确定hASCs的最大浓度。NRVCMs和hASCs共培养物以1500:37.5:0的比例进行光学映射。使用hASCs和HUVECs的共培养来表征血管发育。在hASC:HUVEC比例为0:37.5:75和0:37.5:150时获得了最佳的血管网络。该信息作为体外移植的三培养条件。
图2.纤维蛋白微纤维片的开发和表征。（A）用于制备纤维蛋白微纤维片的静电纺丝工艺示意图。（B）代表性SEM图像，比较了脱细胞或天然心肌与去细胞或NRVCM接种的纤维蛋白微纤维片。（C）块状纤维蛋白微纤维片材的应力-应变曲线，描述了每种纤维蛋白浓度的杨氏模量。（D）聚酯薄膜框架上1cm×1cm纤维蛋白微纤维片的代表性图像。黄色虚线表示聚酯薄膜框架的内部边缘和支架的边界。
图3.纤维蛋白微纤维片上的心肌细胞的形态和电生理特性（A）在0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维片材上均进行α-肌动蛋白（绿色）和连接蛋白-43（红色）的免疫荧光染色。（B）选择0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维心肌细胞组的代表性时间进程（14、28和56天）激活图。（C）培养2周后，在1.0 Hz的起搏速率下纤维蛋白微纤维的各向异性比率为0.75％和2.0％。（D）在1.0 Hz的起搏速率下0.75％纤维蛋白微纤维从中心起搏的代表性激活图。（E-H）比较0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维的传导速度（E）、APD80（F）APD30（G）和最大捕获率（H）（n=4-9）。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图4.纤维蛋白微纤维片的收缩力测量值。（A）0.75％纤维蛋白微纤维的代表性自发力示踪测量。（B）2.0％纤维蛋白微纤维的代表性自发力示踪测量。（C）0.75％（黑色）和2.0％（红色）纤维蛋白微纤维在1 Hz时的代表性刺激收缩力。（D）高达20％应变的纤维蛋白微纤维的受力与长度的关系。
图5.纤维蛋白微纤维片上血管发育的特征。（A）纤维蛋白微纤维上血管发育的示意图。（B）培养7天后对血管组件进行免疫染色，（C）含2％和6％血清的已组装内皮网络的血管长度，（D）含2％和6％血清的已组装血管的互连性，（E）正交视图显示在纤维蛋白微纤维上免疫染色的血管。
图6.带有内皮网络的功能性心脏移植物。（A）示意图显示CM培养14天后，支持细胞（hASC和HUVECs）类型的补播种。（B）分别在0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维片上对CD31/PECAM-1（绿色）管状结构以及心脏肌钙蛋白I（红色）进行免疫荧光染色，细胞浓度范围为1500:37.5:37.5-1500:37.5:150。（C）在三培养中滴度的内皮细胞间血管长度的比较,（D）在三培养中形成的血管结构的互连性的比较。（E）0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维片在1500:37.5:150比例下的代表性激活图谱。（F）在0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维中，与仅NRVCM培养物相比，三培养物的传导速度。（G）0.75％和2.0％纤维蛋白微纤维的动作电位持续时间80和（H）动作电位持续时间30的比较。（I）最大捕获率比较了纤维韧度和NRVCM:hASC:HUVECs的比率。p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图7.带有内皮网络的工程化心脏组织受刺激的收缩力。（A）2.0％纤维蛋白（红色）覆盖0.75％纤维蛋白（黑色）三培养补片收缩力的点步态轨迹，（B）三培养体系收缩力测量的图示。
