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北京航空航天大学樊瑜波Acta Biomater.:一种用于硬脑膜修复的多功能仿生三层复合材料

2021-08-17   易丝帮

硬脑膜缺损及继发性脑脊液(CSF)渗漏通常出现在外伤或神经外科手术中,并伴随着一系列严重的并发症甚至死亡。使用具有阻断渗漏、防止粘连和硬脑膜重建等功能的合格硬脑膜替代物是一种很有前景的治疗途径。然而,即使一些产品已投入临床应用,但没有一种替代品能够达到所需的多功能性。本研究旨在设计并制备一种具有理想多功能的硬脑膜修复复合材料。通过仿生天然硬脑膜的结构和成分,研究者采用L-聚乳酸(PLLA)、壳聚糖(CS)、明胶和脱细胞小肠粘膜下层(SIS)粉末成功制备了三层复合材料。然后,开发了一系列特定的设备和技术来研究其性能。结果表明,在组分间良好的协同相互作用下,可以获得令人满意的结构稳定性。此外,上述研究结果表明,该仿生三层复合材料具有良好的堵漏、防粘连、抗菌、硬脑膜重建等功能,有望成为硬脑膜修复的理想材料。

 

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图1.主要研究过程示意图。


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图2.研究中使用的一些实验设备和模型。(A)模拟体外降解生理环境的硬脑膜缺损模型。缺损模型的示意图(a1)和物理图(a2)。用替代品(顶部的水凝胶层)固定的缺损模型(a3)。(B)建立几何模型的过程。基于25岁健康男性CT图像(b1)重建颅骨(b2),基于白色虚线上方的颅骨部分,构建包括颅骨、修复材料、硬脑膜的几何模型(b3)。(C)成纤维细胞屏障功能实验装置。器件的示意图(c1)和物理图(c2)。用替代品(c3)固定的装置;细胞和材料在装置中的共培养(c4)。比例尺:1cm。


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图3.三层复合材料的宏观和微观形貌。(A)三层复合材料的宏观形貌,包括a1)顶面和底面;a2)横截面;a3)水凝胶。比例尺:1cm。(B)复合材料顶面和底面以及横截面的SEM图像。组合界面中的PLLA和CS/PLLA静电纺丝纤维和水凝胶分别用蓝色、红色和黄色箭头表示。在水凝胶的SEM图像中用红色箭头表示均匀分布在水凝胶内的脱细胞SIS粉末。


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图4.相邻两层之间的组合。(A)PLLA和CS/PLLA纺丝薄膜的组合。PLLA与CS/PLLA纺丝薄膜组合的宏观形貌(a1)和示意图(a2)(PLLA和CS/PLLA静电纺丝纤维分别用黄色和绿色箭头表示);PLLA、CS/PLLA纺丝薄膜和双层的SEM图片(a3)和接触角(a4)。(B)水凝胶和CS/PLLA纺丝薄膜的组合。PLLA静电纺丝薄膜-水凝胶偶联物(b1)和CS/PLLA静电纺丝薄膜-水凝胶偶联物(b2)的SEM图,图中黄色和红色箭头分别代表PLLA纳米纤维和CS/PLLA纳米纤维;CS/PLLA纳米纤维与水凝胶之间的化学相互作用示意图(b3)。


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图5.用镊子弯曲、冷冻干燥和拉伸后三层复合材料的结构稳定性。(A)用镊子(a1)弯曲和冷冻干燥(a3)后复合材料的直观表观。将PLLA-水凝胶偶联物弯曲作为对照(a2)(红色虚线为纺丝薄膜原处,蓝色虚线为未脱落时水凝胶表面PLLA膜的边缘);比例尺:1cm。(B)不同层和复合材料的应力-应变曲线。


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图6.体外降解0、10、20和30天后三层复合材料上下表面和横截面的SEM图像。横截面SEM图像中白色虚线之间的部分是组合界面。


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图7.颅内压生理极限下硬脑膜替代物的最大力学性能。(A)主应力和(B)主弹性应变。


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图8.成纤维细胞抗渗漏功能和屏障功能的体外研究结果。(A)抗渗漏功能研究包括无压液滴渗透(a1-a6)和荧光染料渗透实验(a7-a10)。滴下红色液滴0、15和30分钟后替代品的顶面和底面(a1-a3);红色液滴掉落前的初始状态(a4);红色液滴掉落30分钟后,将红色液滴清洗干净后的上下表面状态(a5-a6)。当荧光染料液滴穿透水凝胶表面5、10、60和120分钟时,复合材料的荧光显微镜图像(黄色虚线代表静电纺丝的下表面)(a7-a10)。比例尺:1cm。(B)细胞培养1、3和5天后,替代品的顶面和底面以及孔板底部的细胞生长。(荧光显微镜图像)比例尺:50μm。


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图9.含0-3%CS的水凝胶对金黄色葡萄球菌(A)和大肠杆菌(B)的抗菌活性。金黄色葡萄球菌(a1-a4)和大肠杆菌(b1-b4)物种粘附在含0-3%CS的水凝胶上的SEM图像。对大肠杆菌(a5)和金黄色葡萄球菌(b5)浮游细菌(Rp)的抗菌率。***p<0.001。


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图10.培养过程中细胞在不同支架上的扩散和附着以及SIS粉末的释放。(A)1、3、5、7天后,在空白板、PLLA膜和有无SIS粉末的水凝胶表面培养的BALB/C 3T3细胞的荧光显微镜图像和(B)CCK-8分析。(C)培养1天和5天后接种在PLLA膜和有无SIS粉末的水凝胶上的细胞的SEM图像。(D)培养0、1、3、5和7天后,用Cy5.5 NHS染色的SIS粉末负载水凝胶的荧光强度。通过荧光显微镜观察SIS粉末的分布。数据表示为平均值±SD(n=5),*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。


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图11.生物相容性、生物活性和结构稳定性的体内研究结果。植入物的H&E(A)以及Masson三色染色(C)。基于HE图像(A),对PLLA膜中细胞浸润深度的定量分析(B)。静电纺丝膜中的细胞浸润由黑色虚线表示。标有黑色“*”的区域代表植入物。植入4周后剩余水凝胶用蓝色箭头标记。(C)中的红色箭头代表降解区域的新血管。手术后2周时植入复合材料的H&E以及Masson三色染色(D),显示出复合材料优异的体内结构稳定性和有效的防粘连能力。PLLA静电纺丝膜中的细胞浸润用蓝色箭头表示,中间层用红色箭头表示。数据表示为平均值±SD(n=5)。*p<0.05,***p<0.001。


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图12.血管化的体内研究结果。(A)植入7、14和28天后水凝胶组以及植入28天的PLLA膜和空白组的CD31免疫组织化学染色,alpha-SMA(绿色)和CD31(红色)免疫荧光染色。红色箭头表示新生血管。(B)血管密度和直径的定量分析,包括第7、14和28天不同直径的血管密度(b1),以及第28天不同组的血管密度(b2)。数据表示为平均值±SD(n=5)。**p<0.01,***p<0.001。


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图13.巨噬细胞极化的定性和定量研究结果。(A)植入3、7和14天后DAPI(蓝色)、CD68(红色)和Arg-1/CCR7(绿色)的免疫荧光染色图像。(B)DAPI群体中CD68+细胞比例(b1)、CD68+群体中CCR7+细胞比例(b2)和CD68+群体中Arg-1+细胞比例的定量分析(b3)。统计学显著性差异由*p<0.05、**p<0.01或***p<0.001表示,经学生t检验确定。

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