冷等离子体固定化骨形态发生蛋白-2增强羧甲基壳聚糖基纳米纤维的成骨诱导

DOI：10.1016/j.carbpol.2019.115681

采用氦冷等离子体（CAP）电纺聚己内酯/羧甲基壳聚糖（PCL/CMC）纳米纤维，植入骨形态发生蛋白-2（BMP-2）作为干细胞向成骨细胞分化的支架材料。体外培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs），通过光学显微镜、MTT法和扫描电镜观察其行为。采用钙含量、碱性磷酸酶测定、茜素红和免疫荧光（ICC）染色、RT-PCR等方法评价人骨髓间充质干细胞的成骨分化。结果表明，支架材料不仅可以支持人骨髓间充质干细胞的增殖，而且可以促进其向成骨细胞的分化，而无需使用任何外源性成骨分化剂。RT-PCR和ICC结果显示CAP处理和BMP-2功能化对人骨髓间充质干细胞的成骨有协同促进作用。这些制备的支架可以作为骨组织工程应用的候选材料。

图1.（a）孵育3天后，植入支架（0.5×0.5 cm²）的人间充质干细胞（10⁴ 个细胞）的光学显微图像。图像的放大倍数为100。S显示支架。（b）孵育1天后，支架上细胞的SEM图像。（c）用MTT法测定细胞在支架上孵育21天的存活率（n=3）。组织培养板用作对照。（d）植入人间充质干细胞的支架在培养21天内的钙含量（n=3）。具有外部成骨分化剂（L-抗坏血酸，10mM，地塞米松，1mM）的组织培养板用作对照。**p≤0.01。

图2. CAP处理前后不同时间的PCL / CMC10％和PCL / CMC15％支架的SEM图像。

图3.（a）孵育3天后，用CAP处理90秒钟后，植入支架（0.5×0.5 cm²）的人间充质干细胞（10⁴个细胞）的光学显微图像。图像的放大倍数为100。S显示支架。（b）孵育7天后，支架上细胞的SEM图像。（c）用MTT法测定细胞在支架上孵育21天的存活率（n=3）。（d）植入人间充质干细胞的支架在孵育21天内的钙含量（n=3）。**p≤0.01和***p≤0.001。

图4. BMP-2固定后，PCL / CMC15％+ P支架的SEM图像。

图5.（a）孵育3天后，植入PCL / CMC15％+ BMP-2支架（0.5×0.5 cm²）的人间充质干细胞（10⁴个细胞）的光学显微图像。图像的放大倍数为100。S显示支架。（b）孵育1天后，PCL / CMC15％+ BMP-2支架上细胞的SEM图像。（c）在孵育21天后，通过茜素红染色显现的，人间充质干细胞植入的PCL / CMC15％+ BMP-2支架的矿化。图像的放大倍数为200。（c）用MTT法测定细胞在支架上孵育21天的存活率（n=3）。（d）植入人间充质干细胞的支架在孵育21天内的钙含量（n=3）。***p≤0.001。

图6.（a）孵育21天后，支架（0.5×0.5 cm²）上骨分化细胞（每个支架10⁴个细胞）的ALP活性（n=3）。**p≤0.01和***p≤0.001。（b）孵育21天后，RT-PCR结果显示支架上骨分化细胞的RUNX2、SOX9、ALP和骨结合蛋白的表达。记录β2M的表达作为对照基因。PCL / CMC15％+ S是具有外部成骨分化剂（10 mM L-抗坏血酸和1 mM地塞米松）的PCL / CMC15％。（c）孵育21天后，ICC结果显示了支架上骨分化细胞的骨连接蛋白表达。比例尺为20 µm。

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