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细胞接种的电纺胶原蛋白支架的分数CO2激光微图案化可在3D工程皮肤中形成表皮突

2019-12-21   易丝帮

DOI:10.1016/j.actbio.2019.11.051

表皮突是皮肤的表皮和真皮的交界处,在稳态中起多种作用,包括通过增加接触面积来增强粘附力并充当表皮干细胞的生态位。但是,工程皮肤(ES)通常不包含这些结构。为了开发具有网状表皮突的工程皮肤,用分数CO2激光处理人成纤维细胞播种的真皮模板,在表面形成间隔均匀的孔。将经过和未经过激光处理的构建体接种角质形成细胞,培养10天,然后移植到无胸腺小鼠上4周。移植时在激光图案化(脊状)样品中观察到表皮突状结构,并在体内得以维持。脊状移植物在移植时和移植后4周显示出比非激光(平坦)移植物更高的屏障功能。体内脊的存在与角质形成细胞增殖、表皮面积和基底膜长度增加相一致。这些结果表明,该方法可用于开发具有表皮突的工程皮肤移植物,脊形模式在移植后至少4周内保持稳定,并且这些脊的存在促进了表皮增殖和屏障功能的建立。


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图1.在播种培养的角质形成细胞之前,激光处理之前(平整,A&B)和之后(脊状,C&D)的成纤维细胞播种的真皮成分的共聚焦图像。微热区在间距和形态上是一致的。激光烧蚀周围的区域由核(蓝色)组成,但不含F-肌动蛋白(绿色)。比例尺=200μm。



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图2.体外培养第1天(A&D),第5天(B&E)和第11天(C&F)的平整(A-C)和脊状(D-F)工程皮肤的层粘连蛋白-332(绿色)和细胞角蛋白(红色)的免疫组织化学染色。在所有切片中,细胞核均用DAPI(蓝色)复染。尽管最初分散在脊突组的真皮中,但到第11天,角质形成细胞浓缩并在网状真皮中形成网状样突起,并具有连续的基底膜。比例尺=100μm。



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图3.在体外通过平整和脊状工程皮肤的表面电容(SEC,B)评估的细胞活力(A)和屏障形成,报告为平均值±SE。在培养第0、1、5和11天时,各组之间的生存力没有显著差异(每组n=6,p>0.05)。在培养的第5天,表面水合作用相似,尽管在培养的第11天,脊状工程皮肤的水合作用明显低于平整工程皮肤(每组n=6,p<0.01)。用单因素方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。



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图4.培养第1、5和11天的平整和脊状工程皮肤的PCR分析,报告为平均值±SE。AXIN2(A),LGR6(B)和LRIG1(D)表达在第5天达到峰值。在第11天,脊状样品的AXIN2,DLL1(C)和LRIG1表达增加(p<0.05)。用单向方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。



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图5.在第2周(A&C)和第4周(B&D)处,平整(A&B)和脊状(C&D)移植物的体内图像。两组的外观和收缩随时间变化相似。所有图像以相同焦距拍摄。比例尺= 0.5cm。



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图6.移植后第2周(每组n=12)和移植后第4周(每组n = 6)平坦和脊状移植物的表皮水分损失(TEWL),报告为平均值±标准误差。在移植物对面的背部测量正常小鼠皮肤(第4周,n=12),平均值用虚线表示。随着时间的推移,两组的TEWL均显著下降。但是,在第4周,仅脊状移植物显示出与正常小鼠皮肤相似的值(p>0.05)。用单向方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。



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图7.移植后1周(A&E)、0周(B&F)、2周(C&G)和4周(D&H)的扁平(A-D)和脊状(E-H)的细胞核(蓝色)、层粘连蛋白-332(绿色)、Ki67(红色)和兜甲蛋白(白色)的免疫组化染色。在所有切片中,用DAPI(蓝色)标记细胞核。在移植时形成网脊,并在移植后4周持续存在。比例尺=100μm。



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图8.在体外培养第5天(第1周)、移植时(第0周)和移植后第2周和第4周,在40倍放大倍率下(每组离散FOV,n=16),每个视野的平坦和脊状样品的基底膜长度(A)、表皮面积(B)和Ki67+角质形成细胞(C)的定量,报告为平均值±SE。脊状标本基底膜长度(层粘连蛋白332+染色距离)在各时间点均较大。表皮区域,即层粘连蛋白332+染色的表浅区域,移植时脊状样品中的表皮区域增加,并在体内保持不变。角质形成细胞增殖,即层粘连蛋白322+染色表面的Ki67+细胞数量,在移植前和移植后一周增加。用单向方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。



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图9.移植时(A&D),移植后2周(B&E)和移植后4周(C&F)的扁平样品(A-C)和脊状样品(D-F)进行三色染色。在第0周时,扁平样品中胶原蛋白的含量增加,而脊状样品显示出更长的真皮表皮交界处。在第2周时,脊状样品的真皮从第0周起明显增加了胶原蛋白的沉积并致密化。在第4周,脊状样品显示出高于平坦样品的胶原蛋白染色密度和强度。比例尺= 100μm。



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图10.移植后第4周,对扁平(A-D)和脊状(E-H)标本的角蛋白2(A&E,绿色)、6(C&G,绿色)和15(B&F,红色)、ITGA6(A&E,红色)、ITGB1(D&H,绿色)和骨膜蛋白(B&F,绿色)进行免疫染色。细胞核用DAPI(蓝色)复染。虽然由于基底膜长度和表皮面积的增加,脊状组的整体存在增加了,但两组之间没有观察到局部差异。比例尺=50μm。



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图11.移植时以及移植后2和4周时,平坦和脊状工程皮肤的基因表达分析,报告为平均值±标准误差。AXIN2(A)、LRG6(B)和LRIG1(D)的表达随时间增加,而DLL1(C)的表达在两组中均降低(每组每个时间点n=6,p<0.05)。用单向方差分析、图基事后检验法且p <0.05来确定统计显著性。



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