DOI:10.1016/j.actbio.2019.11.051
表皮突是皮肤的表皮和真皮的交界处，在稳态中起多种作用，包括通过增加接触面积来增强粘附力并充当表皮干细胞的生态位。但是，工程皮肤（ES）通常不包含这些结构。为了开发具有网状表皮突的工程皮肤，用分数CO2激光处理人成纤维细胞播种的真皮模板，在表面形成间隔均匀的孔。将经过和未经过激光处理的构建体接种角质形成细胞，培养10天，然后移植到无胸腺小鼠上4周。移植时在激光图案化（脊状）样品中观察到表皮突状结构，并在体内得以维持。脊状移植物在移植时和移植后4周显示出比非激光（平坦）移植物更高的屏障功能。体内脊的存在与角质形成细胞增殖、表皮面积和基底膜长度增加相一致。这些结果表明，该方法可用于开发具有表皮突的工程皮肤移植物，脊形模式在移植后至少4周内保持稳定，并且这些脊的存在促进了表皮增殖和屏障功能的建立。
图1.在播种培养的角质形成细胞之前，激光处理之前（平整，A＆B）和之后（脊状，C＆D）的成纤维细胞播种的真皮成分的共聚焦图像。微热区在间距和形态上是一致的。激光烧蚀周围的区域由核（蓝色）组成，但不含F-肌动蛋白（绿色）。比例尺=200μm。
图2.体外培养第1天（A＆D），第5天（B＆E）和第11天（C＆F）的平整（A-C）和脊状（D-F）工程皮肤的层粘连蛋白-332（绿色）和细胞角蛋白（红色）的免疫组织化学染色。在所有切片中，细胞核均用DAPI（蓝色）复染。尽管最初分散在脊突组的真皮中，但到第11天，角质形成细胞浓缩并在网状真皮中形成网状样突起，并具有连续的基底膜。比例尺=100μm。
图3.在体外通过平整和脊状工程皮肤的表面电容（SEC，B）评估的细胞活力（A）和屏障形成，报告为平均值±SE。在培养第0、1、5和11天时，各组之间的生存力没有显著差异（每组n=6，p>0.05）。在培养的第5天，表面水合作用相似，尽管在培养的第11天，脊状工程皮肤的水合作用明显低于平整工程皮肤（每组n=6，p<0.01）。用单因素方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。
图4.培养第1、5和11天的平整和脊状工程皮肤的PCR分析，报告为平均值±SE。AXIN2（A），LGR6（B）和LRIG1（D）表达在第5天达到峰值。在第11天，脊状样品的AXIN2，DLL1（C）和LRIG1表达增加（p<0.05）。用单向方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。
图5.在第2周（A＆C）和第4周（B＆D）处，平整（A＆B）和脊状（C＆D）移植物的体内图像。两组的外观和收缩随时间变化相似。所有图像以相同焦距拍摄。比例尺= 0.5cm。
图6.移植后第2周（每组n=12）和移植后第4周（每组n = 6）平坦和脊状移植物的表皮水分损失（TEWL），报告为平均值±标准误差。在移植物对面的背部测量正常小鼠皮肤（第4周，n=12），平均值用虚线表示。随着时间的推移，两组的TEWL均显著下降。但是，在第4周，仅脊状移植物显示出与正常小鼠皮肤相似的值（p>0.05）。用单向方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。
图7.移植后1周（A&E）、0周（B&F）、2周（C&G）和4周（D&H）的扁平（A-D）和脊状（E-H）的细胞核（蓝色）、层粘连蛋白-332（绿色）、Ki67（红色）和兜甲蛋白（白色）的免疫组化染色。在所有切片中，用DAPI（蓝色）标记细胞核。在移植时形成网脊，并在移植后4周持续存在。比例尺=100μm。
图8.在体外培养第5天（第1周）、移植时（第0周）和移植后第2周和第4周，在40倍放大倍率下（每组离散FOV，n=16），每个视野的平坦和脊状样品的基底膜长度（A）、表皮面积（B）和Ki67+角质形成细胞（C）的定量，报告为平均值±SE。脊状标本基底膜长度（层粘连蛋白332+染色距离）在各时间点均较大。表皮区域，即层粘连蛋白332+染色的表浅区域，移植时脊状样品中的表皮区域增加，并在体内保持不变。角质形成细胞增殖，即层粘连蛋白322+染色表面的Ki67+细胞数量，在移植前和移植后一周增加。用单向方差分析、图基事后检验法且p<0.05来确定统计显著性。
图9.移植时（A＆D），移植后2周（B＆E）和移植后4周（C＆F）的扁平样品（A-C）和脊状样品（D-F）进行三色染色。在第0周时，扁平样品中胶原蛋白的含量增加，而脊状样品显示出更长的真皮表皮交界处。在第2周时，脊状样品的真皮从第0周起明显增加了胶原蛋白的沉积并致密化。在第4周，脊状样品显示出高于平坦样品的胶原蛋白染色密度和强度。比例尺= 100μm。
图10.移植后第4周，对扁平（A-D）和脊状（E-H）标本的角蛋白2（A&E，绿色）、6（C&G，绿色）和15（B&F，红色）、ITGA6（A&E，红色）、ITGB1（D&H，绿色）和骨膜蛋白（B&F，绿色）进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。虽然由于基底膜长度和表皮面积的增加，脊状组的整体存在增加了，但两组之间没有观察到局部差异。比例尺=50μm。
图11.移植时以及移植后2和4周时，平坦和脊状工程皮肤的基因表达分析，报告为平均值±标准误差。AXIN2（A）、LRG6（B）和LRIG1（D）的表达随时间增加，而DLL1（C）的表达在两组中均降低（每组每个时间点n=6，p<0.05）。用单向方差分析、图基事后检验法且p <0.05来确定统计显著性。
