DOI: 10.1021/acsbiomaterials.9b01068
肿瘤微环境具有肿瘤进展所需的基本成分，包括生化信号和机械提示。为了研究微环境因素对尤因肉瘤（ES）发病机制的影响，我们从电纺聚己内酯（PCL）支架中构建了一个无细胞三维骨肿瘤生态位，该支架包含骨样结构、细胞外基质（ECM）和矿化作用。PCL-ECM构建体是由含有成骨性人间充质干细胞（MSCs）培养的PCL支架脱细胞而成。与单纯PCL支架相比，PCL-ECM构建体在体内模拟肿瘤结构并增加ES细胞增殖。与单层对照相比，3D环境通过雷帕霉素（mTOR）的机制性靶点促进了典型胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）信号级联的下调，两者都是近期临床试验的靶点。除了下调典型的IGF-1R信号传导外，3D环境还促进了IGF-1R的核定位和转录活性的降低，体外药物试验显示3D环境产生了对mTOR抑制和化疗耐药性细胞表型。我们的多功能PCLECM结构允许研究各种微环境元素在ES肿瘤生长、癌细胞形态和诱导耐药性细胞表型中的作用。
图1.三维PCL-ECM结构的生成。（A）从电纺PCL和成骨MSC培养（OsMSCs）构建三维骨肿瘤龛的过程示意图。（B）脱细胞前后，在电纺PCL支架上的成骨培养基中培养12天的OsMSCs的代表性共焦图像（蓝色，Hoechst表示细胞核；绿色，鬼笔环肽表示肌动蛋白；比例=50μm）。（C）脱细胞前后在电纺PCL支架上成骨培养基中培养12天的OsMSCs的代表性扫描电镜照片（左面板：比例=200μm；右面板：比例=20μm）
图2.PCL支架中OsMSCs的成骨特性的表征。（A）在基础培养基（MSC）中以单层培养的未分化MSC，在成骨培养基中以单层培养的MSC（OsMSC）或在成骨培养基中以PCL支架培养的MSC（PCL+OsMSC）中检测到的碱性磷酸酶（ALP）活性持续12天（n=5）。Tukey HSD事后检测的单向方差分析：n.s.＝无显着性，*p＜0.05。（B）在没有细胞（PCL）或有OsMSC（PCL+OsMSC）的成骨培养基中孵育12天的支架的钙含量（n=5）。学生的t检验***p<0.001。（CD）两个具有OsMSC的脱细胞PCL支架的25μm代表性切片，它们构成PCL-ECM构建体，用茜素红（C）染色以沉积钙，或用Masson 三色染色（D）细胞核（深蓝色），非胶原蛋白（红色）和胶原蛋白（蓝色）。PCL-ECM构造的表面朝向图的顶部。比例=50μm。
图3.骨肿瘤微环境中ES的增殖和形态。（A）在96孔板中以单层，直径6 mm的PCL支架或直径6 mm的PCL-ECM构建体（n=5）培养的ES细胞的细胞计数。带有Tukey HSD事后检测的双向方差分析：n.s.＝无显着性，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。（B）代表性的SEM显微照片，描绘了PCL支架和PCL-ECM构建体上的ES细胞和ECM的形态。红色箭头指示3D环境中的拓扑变化（左图：比例=200 µm；右图：比例=20 µm）。（C）代表性的共聚焦图像，描述了单层培养的ES细胞在PCL支架上或PCL-ECM构建体（蓝色，Hoechst；绿色，鬼笔环肽；比例=50 µm）上的生长和聚集。（D）ES细胞的代表性共聚焦显微镜图像，描述了可变微环境中的形态变化。白色箭头表示单层细胞中明显的丝状伪足，红色箭头表示细胞包裹在PCL纤维周围，白色箭头表示PCL-ECM结构中ECM沉积的区域，在该区域周围细胞呈球状生长（比例=20 µm）。
图4. IGF-1R的激活。（A）代表性的共聚焦图像，描绘了单层培养的ES细胞在PCL支架上或在PCL-ECM构建体上的IGF-1R的激活和定位（蓝色，Hoechst代表核；绿色，鬼笔环素代表肌动蛋白；红色，IGF-1R ；青色，pIGF-1R；比例=50 µm）。（B）Western免疫印迹突出了单层培养的ES细胞在PCL支架或PCL-ECM构建体上培养5天的IGF-1R/mTOR信号级联激活的过程。（C）Western免疫印迹突出显示了IGF-1R转录复合物活性、FAM21A和c-JUN下游产物的表达。组蛋白H3的负载对照印迹（B）和（C）与来自同一实验的代表性印迹相同。
图5.对网格蛋白抑制的IGF-R激活和定位反应。（A）和（B）单层培养的ES在PCL支架和PCL-ECM构建体上的代表性共聚焦显微图像，以及描绘与小分子网格蛋白抑制剂Pitstop®2孵育20分钟之前和之后，IGF-1R的定位（A）或pIGF-1R的定位（B）（比例=50 µm）（C）IGF-1R（左）或pIGF-1R（右）的核共定位的Manders共域系数（MCC），由扣除滚动球背景和转换Costes自动阈值后的6个共聚焦图像计算得出。Tukey HSD事后检测的双向方差分析：字母代表独立组，p<0.05；****p<0.0001；n.s.=无显著性；字母相同的组没有显著性差异。
图6.3D培养物可促进ES对mTOR抑制和阿霉素的抗性。与未经处理的对照组相比，用（A）地磷莫斯和（B）达洛妥珠单抗（n=8）处理3天后，单层培养的ES细胞在PCL支架或PCL-ECM构建物中存活的百分比。Tukey HSD事后检测的单向方差分析：字母代表独立组，p<0.05；n.s.=无显著性；字母相同的组没有显著性差异。（C）添加或不添加IGF-1R/mTOR靶向治疗对阿霉素的剂量反应曲线。比较了阿霉素单独治疗组之间的阿霉素剂量反应（左图）；mTOR抑制剂地磷莫斯（中图）；或在IGF-1R靶向单克隆抗体达洛妥珠单抗存在下使用阿霉素（右图）。使用S形，四参数对数回归拟合剂量-反应曲线。每个点均显示为平均值±标准偏差。（对于每个阿霉素浓度，n=3）。
