DOI：10.1016/j.apmt.2019.100495
合适的生态位环境是间充质干细胞（MSCs）参与肌腱分化和再生的关键因素。本研究利用可溶性肌腱衍生细胞外基质（sTECM）对定向电纺纤维进行酸中和改性，以期为肌腱再生创造一个最佳的生态位环境，并利用小鼠MSC体外成腱分化和大鼠跟腱再生评价其功效。结果表明，sTECM修饰的超微粒子具有更高的细胞相容性，并能诱导小鼠骨髓间充质干细胞的显性成肌表型，其中包括硬化剂、肌动蛋白、胶原Ⅲ、莫霍克同源盒、核心蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖等肌腱标志物的增强表达。相比之下，纯sTECM组分可促进小鼠MSCs的多系分化，包括腱系分化。这种诱导作用在体内单侧机械负荷时进一步增强。此外，sTECM修饰支架的植入为肌腱的原位再生创造了一个理想的生态位环境，包括具有生物活性的sTECM成分、拓扑和机械信号。结果表明，与未改性的肌腱组织相比，sTECM改性的肌腱组织具有组织结构更成熟、组织结构更好、细胞密度和排列更整齐、胶原超微结构更好的特点。定量分析显示，与对照组相比，胶原纤维直径明显增大，力学性能增强，组织分级评分明显提高，成腱标志物表达水平明显提高（p<0.05）。这项研究表明，sTECM修饰的pH中性超纤维可能是一种新型的肌腱原位再生生物活性支架，有待在大动物中进一步研究。
图1.示意流程图说明了实验设计。
图2.sTECM改性酸中和超细纤维的制备与表征。如图所示，制备了A. sTECM改性壳芯结构超纤维。B.脱细胞后，牛屈肌腱中的天然腱细胞被完全去除。C.组织dsDNA浓度显示细胞DNA含量完全去除。D.SDS-PAGE电泳显示脱细胞TECM颗粒（泳道 1）和sTECM（泳道 2）的蛋白条带分布。E.平行CTS/PLGA和（sTECM-CTS）/PLGA超细纤维的SEM和TEM图像。F.为了测量接触角，拍摄了水滴在3个不同时间点下落的照片。之前，在水与物质接触之前。0秒，水即将接触到材料表面。1s，水与材料接触后1秒。测量1s时的接触角（**p<0.01）。G.CTS/PLGA和（sTECM-CTS）/PLGA支架的应力-应变曲线。H.CTS和冻干sTECM的FTIR光谱以及PLGA、CTS/PLGA和（sTECM-CTS）/PLGA电纺定向纤维的红外光谱，显示了它们各自的特征吸收峰。
图3.sTECM改性酸性中和超细纤维的体外实验表明，其具有较好的生物相容性和诱导能力。A.将骨髓间充质干细胞接种于超细纤维上，进一步观察细胞的黏附、活力、增殖和肌腱分化情况。B.CCK-8分析显示（sTECM-CTS）/PLGA在第7天对细胞增殖有轻微的优势。C.扫描电镜显示细胞接种后第1天在两种类型的超细纤维上均显示出细长的细胞形态。第7天，在sTECM改性的超细纤维上观察到更多的胶原沉积。D.活细胞/死细胞分析显示，第7天，sTECM改性的超细纤维上的死细胞较少。放大倍率为100×；比例尺=200 μm。E.在sTECM改性的超细纤维上培养7天和14天时，细胞表达了更高水平的多种肌腱基因。误差条表示标准误差。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
图4.sTECM改性的超细纤维促进了大鼠跟腱体内再生。A.再生肌腱和正常跟腱的大体图和组织学。H&E染色显示界面部和中部的组织结构。胶原纤维及其亚型分别通过Masson三色染色和Sirius红染色（在偏振光下观察）识别。 放大倍率，100×，比例尺=250 m。 B.对FS、FA、RN、VC和DC参数的组织学评分表明，sTECM改性的超细纤维的体内优点。*p<0.05。
图5.sTECM改性的超细纤维改善了新肌腱的超微结构和生物力学性能。A.插图展示了正常肌腱的超微结构和透射电镜图像。本研究采用透射电镜观察胶原纤维。放大倍率，12000x；比例尺=200nm。B.透射电镜显示，移植后12周，ECM组在两个时间点都有胶原纤维，ECM组的胶原纤维直径增加。放大倍率，12000x；比例尺=200 nm。C. 直方图显示胶原纤维直径。D.检测体内工程肌腱和正常跟腱的最大载荷、杨氏模量和抗拉强度。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
图6.sTECM诱导MSCs体外成腱分化，促进新生组织中成腱基因的表达。A.除COL1外，ECM组的成腱基因表达上调。此测定法中的误差条表示标准误差。B.用sTECM培养时，细胞维持其星状或扩展的形态。放大倍率，50×；比例尺=100μm。C，CCK-8分析显示sTECM处理后MSCs细胞增殖延迟。D.用sTECM培养3天后，与成腱分化相关的标记基因表达上调。误差线表示标准误差。综上所述，sTECM在体外能够诱导MSCs的成腱分化，并能增强体内募集的宿主细胞的成腱表型。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
