收缩性肌球蛋白环和cofilin介导的肌动蛋白分解协同ECM纳米形貌传感

DOI：10.1016/j.biomaterials.2019.119683

细胞外基质（ECM）的纳米形貌和纳米级几何结构是细胞粘附、运动和命运决定的重要调控因子。然而，与基质力学和ECM密度的传感不同，调控ECM纳米形貌和纳米级几何结构直接传感的分子过程尚不十分清楚。本文中，研究者使用由电纺纳米纤维光刻（ENL）生成的纳米形貌图案来研究细胞对纳米形貌的传感机制。观察到肌动蛋白动力学失调，导致肌动蛋白病灶的惊人形成。肌动蛋白组织的这种改变是由肌球蛋白收缩力调节的，但不依赖于长春新碱等适配蛋白。该过程高度依赖于差异整合素的表达，β3整合素表达细胞比β1整合素细胞对纳米图案尺寸更敏感，并且显示出肌动蛋白组装和肌动蛋白灶形成的扰动增加。作者认为，在β3整合素表达细胞中，收缩力导致纳米肌动蛋白网络的失稳，塌陷成焦点并隔离肌动蛋白动力学的调节因子，如协同分解的cofilin。因此，与通过粘着力组装直接协同的基底力学和ECM配体密度传感相反，作者提出的纳米形貌传感是受远程传感机制调节的，远离焦点粘附并由肌动蛋白结构介导。

图1.通过电纺纳米纤维光刻技术（ENL）生成的纤维粘合剂图案。a.细胞在纳米纤维上扩散的示意图。放大：与纳米图案化基底接触的细胞膜的示意图，用聚合物刷控制粘性纳米纤维的宽度（d）和非粘性的高度的步骤（h）。b.纳米纤维的表征。直径为250和1000 nm的SEM（扫描电子显微镜）图像（顶部）。具有高度轮廓的500 nm纤维的AFM（原子力显微镜底部）。比例尺，2μm。

图2.纳米模式对细胞粘附的调节与肌动蛋白病灶的发生有关。a.肌动蛋白细胞骨架在纳米图案化基底上扩散的图像。实验用LifeAct转染GEβ3细胞。比例尺为20μm。b.细胞扩散受纳米纤维宽度（250、500和1000 nm）和抗粘附背景高度（10、30和60 nm）的影响。c.延时图像（见补充视频1-4）显示细胞在纳米图案化基底上扩散，并显示肌动蛋白应力纤维随着纳米图案化尺寸（红色箭头）的变化而日益断裂，以及在纳米图案化基底上扩散时肌动蛋白焦点的形成（蓝色箭头）。d.肌动蛋白在纳米图案化基底上发生的量化。误差条为s.e.m.，n≥3；每个条件下每个重复样本至少100个细胞；**，P<0.01；**，P<0.00001；n.s.，无显著性；统计分析见补充表1和表2。

图3. GEβ1细胞对纳米纤维直径的反应减弱。a.GEβ1细胞（用LifeAct转染）肌动蛋白细胞骨架在纳米图案化基底上扩散的图像。比例尺为20 μm。b.与GEβ3细胞相比，细胞扩散对纳米纤维宽度（250、500和1000 nm）和抗粘附背景高度（10和30 nm）的响应降低（见图2）。c.GEβ1细胞在纳米图案化基底上扩散的延时图像（见补充视频5-8）。细胞骨架组装和应力纤维（红色箭头）稳定性受到干扰，尽管与GEβ3细胞相比，最薄的纳米纤维（250纳米）上仍然存在。在所有的纳米图案（蓝色箭头）上观察到GEβ1细胞很少有肌动蛋白病灶。d.肌动蛋白在纳米图案化基底上发生的量化。与对照条件进行比较。误差条为s.e.m.，n≥3；每个条件下每个重复样本至少100个细胞；**，P<0.01；**，P<0.00001；n.s.，无显著性；统计分析见补充表3和表4。

图4.长春新碱不是纳米形貌传感的关键调节因子。a.长春新碱募集随不同纳米图案化基底的粘附大小的变化。b.相应代表性的长春新碱染色图像。比例尺为20μm。c.细胞上长春新碱KO对基质纳米形貌的响应以及长春新碱构建体（Vinc.）和显性阴性构建体（Vin880）或组成性活性构建体（VinT12）重新表达后的影响。d. 相应的长春新碱和鬼笔环肽图像。比例尺为50μm。误差条为s.e.m.，n≥3；每个条件下每个重复样本至少100个细胞；*，P<0.05；***，P<0.001；n.s.，无显著性；统计分析见补充表5和表6。

图5.肌动蛋白动力学而不是黏着斑的稳定作用，可调节纳米形貌传感。a.用Arp2/3（ck666）和formin同源2结构域（smifH2）抑制剂处理的GEβ3细胞对基质纳米形貌的响应仅部分降低。b.用福尔明抑制剂处理过的细胞的相应图像。比例尺为10μm。绿色，新蛋白；红色，F-肌动蛋白。c.未转染细胞（空白）或用α-辅肌动蛋白siRNA1转染的相应图像。比例尺为10μm。绿色，α-辅肌动蛋白；红色，F-肌动蛋白。d.α-辅肌动蛋白击倒后细胞对基质纳米形貌的响应仅部分降低（α-辅肌动蛋白-1和-2是针对α-辅肌动蛋白的两种不同siRNA；N.T.，非靶向性）。误差条为s.e.m.，n≥3；每个条件下每个重复样本至少100个细胞；*，P<0.05；n.s.，无显著性；统计分析见补充表8和9。有趣的是，未发现GEβ1细胞受到两种抑制剂的影响（补充图10a/b），并且在所有测试条件下，无论处理过的细胞还是未经处理的细胞，它们对纳米形貌的响应都相似。

图6.收缩性肌球蛋白环调节GEβ3细胞骨架结构和纳米形貌传感。a.肌动蛋白细胞骨架的扰动破坏了纳米形貌的传感。b.细胞骨架破坏后，细胞粘附在纳米结构上持续的时间更长。Blebistatin的比例尺为100μm，Y-27632的比例尺为20μm。绿色，长春新碱；红色，F-肌动蛋白。c.肌球蛋白环在肌动蛋白病灶周围形成。延时成像突出肌动蛋白焦点和肌球蛋白环的动态（见补充视频9-11）。比例尺为20μm。误差条为s.e.m.，n≥3；每个条件下每个重复样本至少100个细胞；**，P<0.01；n.s.，无显著性；统计分析见补充表10。

图7.Cofilin和肌动蛋白的分解协调了纳米形貌传感。a.在纳米模式上扩散的GEβ3细胞中形成的肌动蛋白灶处募集cofilin。比例尺为20μm。b.细胞在纳米模式上扩散的延时成像，并清晰显示肌动蛋白病灶处cofilin的共聚焦（见补充视频12-14）。c.cofilin的敲除破坏了细胞对基质纳米形貌的响应（CFL-1和-2是针对cofilin的siRNA；N.T.，非靶向性）。比例尺为100μm。误差条为s.e.m.，n≥3；每个条件下每个重复样本至少100个细胞；***，P<0.001；n.s.，无显著性；统计分析见补充表13。

图8.基质纳米形貌的细胞传感调控机制。细胞骨架的正常结构及其机械稳态在纳米图案化基底上扩散的细胞中受到干扰，其中粘附只能沿着由ECM几何形状确定的某些轴形成。这导致肌动蛋白细胞骨架的不稳定（但不是黏着斑），并形成收缩性肌球蛋白环和肌动蛋白灶。在这些病灶处的Cofilin募集导致细胞骨架的分解。因此，细胞骨架及其复杂的动力学表现为基质纳米形貌的主要传感器，而不是黏着斑。